Dünnschichtchromatographie (DC)

Synonyme

• Thin Layer Chromatography (TLC)

Trennprinzip

• Adsorption

Trennleistung

N	:	Trennleistung (theoretische Bodenzahl)
x	:	Abstand des Substanzflecks vom Ursprung
w	:	Fleckdurchmesser

• Die Trennleistung ist also umso höher, je kleiner der erhaltene Fleckdurchmesser und je weiter die einzelnen Substanzflecke vom Auftragungsort entfernt sind.

Auflösung

RS	:	Auflösung
d	:	Abstand der Mitten zweier Substanzflecke
w1, w2	:	Durchmesser der einzelnen Substanzflecke

Stationäre Phase

• Kieselgel
  • Die eigentliche stationäre Phase ist meist Kieselgel. Da Kieselgel auf den meist als Träger verwendeten Glasplatten jedoch nur schlecht haftet, wird oftmals Gips (CaSO₄) als "Kleber" beigemengt. Diese Platten werden mit einem "G" im Namen gekennzeichnet, Platten mit reinem Kieselgel tragen den Zusatz "H".
  • Zur vereinfachten Auswertung der Chromatogramme sind auch Platte mit "eingebautem" Fluoreszenzindikator erhältlich, die den Namenszusatz "F" sowie eine Zahl tragen. Die Zahl entspricht der Anregungswellenlänge in nm des Indikators, z.B. 254 nm. Der Indikator fluoresziert meist in hellgrün, an den Substanzflecken findet keine Fluoreszenz statt, da hier das UV-Licht absorbiert wird bevor es den Indikator erreichen kann; diese Stellen erscheinen folglich dunkel. Dieses auf Verfahren wird, vom Prinzip her falsch, als "Fluoreszenzlöschung" bezeichnet. Es funktioniert bei allen Stoffen, die Chromophore aufweisen, die im Bereich der Anregungswellenlänge des Indikators absorbieren, z.B. Aromaten, Verbindungen mit Carbonylfunktionen etc.
  • Die Aktivität des Kieselgels wird stark von seinem Wassergehalt beeinflusst; durch steigenden Wassergehalt sinkt die Aktivität ab, der R_F-Wert steigt. Dies kann u.U. zur Verbesserung der Wanderung der Probe eingesetzt werden, allerdings ist dieser Einfluss umso geringer, je polarer das verwendete Fließmittel ist.
  • Die Änderung der Schichtaktivität verändert auch die Selektivität der Schicht, die Trennleistung und die Auflösung. 
  • Für die Wechselwirkungen mit der Probe sind polare OH-Gruppen an der Oberfläche verantwortlich.
  • Das eingesetzte Kieselgel weist eine sehr große Oberfläche auf, die neben der kleinen Partikelgröße auch auf relativ großen (600 - 800 nm) Poren beruht.
  • Die Trennleistung kann durch den Einsatz sehr feinkörniger Materialien mit möglichst einheitlicher Korngrößenverteilung deutlich erhöht werden. Dies wird in der HPTLC ausgenutzt.
• Aluminiumoxid  
  • Aluminiumoxid wird nur noch vereinzelt eingesetzt.
• Kieselgur  
  • Im Gegensatz zu Kieselgel ist Kieselgur nahezu unpolar.
• Cellulose
  • Beim Einsatz von Cellulose als stationärer Phase handelt es sich praktisch ausschließlich um Verteilungschromatographie, die Adsorption spielt nahezu keine Rolle mehr.

Fließmittel

• Das Fließmittel bildet nach der Gleichgewchtseinstellung mit dem Sorbens die trennwirksame mobile Phase. Es entscheidet im Zusammenwirken mit der stationären Phase über Selektivität und Trennleistung des Systems.
• In der Adsorptionschromatographie konkurrieren die Substrat- und Fließmittelmoleküle um die aktiven Zentren der stationären Phase.
• Die Auswahl des Fließmittels erfolgt anhand der eluotropen Reihe.
• Je stärker die Elutionskraft eines Fließmittels ist, desto schwächer sind die Wechselwirkungen der Probe mit der stationären Phase; folglich steigt der R_F-Wert an. 
• Sind polare Substanzen zu trennen, so werden polare Fließmittel, sind unpolare Substanzen zu trennen, werden unpolare Fließmittel eingesetzt.
• Problematisch ist die Fließmittelwahl unter Umständen bei Substanzen, die weder richtig unpolar, noch richtig polar sind. Hier lässt sich die Trennung oftmals durch mehrfache Entwicklung der Platte mit verschiedenen Fließmitteln verbessern. Allerdings werden dabei u.U. bereits gut getrennte Substanzen wieder schlechter aufgelöst. 
• Meist steigert man die Polarität des Fließmittels zwischen den einzelnen Entwicklungen, da bei der Verwendung von "normalem" Kieselgel die stationäre Phase immer polar ist und so durch eine Erhöhung der Polarität des Fließmittels sich die Laufstrecke der Substanzen erhöhen lässt, da nun die Wechselwirkungen zwischen stationärer Phase und Probe stärker gestört werden.

Aufbau

• Die stationäre Phase ist auf einen Träger, z.B. Glas, Kunststoff oder Aluminiumfolie aufgetragen.
• Diese chromatographische Platte muss unbeschädigt sein und wird nun vorsichtig mit Bleistift markiert (Startpunkte, Laufstrecke). Dabei sind die Startpunkte in einem Abstand von min. 15 mm von der Unterkante der Platte parallel zu dieser und ebenso weit voneinander entfernt aufzutragen. Oberhalb der Laufstreckenmarkierungen werden de Substanzen und experimentellen Daten notiert.
• Anschließend werden die vorbereiteten Lösungen mittels graduierter Kapillaren aufgetragen. Je kleiner der Startfleck ist, desto besser ist das Trennergebnis.
• Nach dem Auftragen bleibt die Platte ca. 10 min an der Luft liegen, um die Lösemittel verdampfen zu lassen, erst danach wird die Platte entwickelt.
• Die Entwicklung erfolgt indem die Platte aufrecht in die vorbereitete Chromatographierkammer gestellt wird. Für übliche Chromatographierkammern werden 100 - 200 ml Fließmittel benötigt. Die Atmosphäre in der Kammer muss vor Beginn der Trennung mit Fließmittel gesättigt werden, um die Trennergebnisse nicht durch Verdunstungseffekte zu verfälschen. Dazu wird die Kammer mit Filterpapier ausgekleidet, das mit dem Fließmittel getränkt ist und abgedeckt ca. 15 min stehen gelassen.
• Die Platte muss so ins Fließmittel gestellt werden, dass alle Startflecken genau parallel zur Flüssigkeitsoberfläche sind.
• Während der Entwicklung ist die Kammer geschlossen und vor Zugluft sowie Wärmequellen geschützt zu halten.
• Wenn das Fließmittel die zuvor aufgetragene Markierung der Laustrecke erreicht hat, wird die Platte aus der Kammer genommen und an der Luft getrocknet.
• Anschließend erfolgt die Auswertung bzw. Detektion.

Auswertung

• Qualitativ
  • Betrachtete Parameter sind die Laufstrecke, die Farbe / Intensität und das UV-Verhalten.
  • Sicherste Methode ist der direkte Vergleich mit einer die Probesubstanz enthaltenden Referenz auf der gleichen Platte. Sollte dies nicht möglich sein, kann mit Hilfe folgender Werte gearbeitet werden:
  • R_F-Wert
    • Abkürzung für englisch "retention factor"
    • Der R_F-Wert ist der Quotient aus dem zurückgelegten Weg der Substanz und dem des Fließmittels.
    • Er ist abhängig von äußeren Bedingungen wie Luftfeuchtigkeit, Temperatur etc.
    • Der R_F-Wert muss kleiner oder gleich eins sein.

  

  • R_St-Wert
    • Abkürzung für englisch "retention standard"
    • Der R_St-Wert gibt das Verhältnis des zurückgelegten Weges der Substanz zu dem einer Referenzsubstanz an.
    • Je nach Vergleichslösung kann er Werte von unter oder über eins annehmen.

  

• Halbquantitativ
  • Vergleich der auch zur qualitativen Auswertung herangezogenen Parameter mit einer Referenz bekannter Konzentration
  • Da zwischen der Fleckgröße und der Masse ein Zusammenhang besteht () wird die halbquantitative Auswertung im Arzneibuch auch als direkter Reinheitsnachweis eingesetzt. Voraussetzung dafür ist jedoch ein R_F-Wert zwischen 0,3 und 0,5.
• Quantitativ
  • direkt
    • Densiometrie
    • Spektralphotometrie
    • Radiometrie
    • Szintillationsmessung
  • indirekt (nach Extraktion)
    • Photometrie
    • Gravimetrie
    • Titrimetrie
    • Polarimetrie
    • Polarographie
    • IR-Spektrometrie
    • Massenspektrometrie
    • NMR-Spektrometrie
    • Isotopenmessung
    • Phosphoreszenzmessung
    • Fluorimetrie
    • AAS
    • Enzymatische Bestimmungen

Detektion

• ohne chemische Reaktion durch
  • Eigenfarbe
  • Fluoreszenz (bei UV-Bestrahlung)
  • Fluoreszenzminderung (bei in der DC-Platte vorhandenem Fluoreszenzindikator)
• Farbreaktion auf der Schicht
  • Vorgehen
    • Aufsprühen von Reagenzien
    • Baden der Platte in einer Reagenzlösung
    • "Räuchern" mit gasförmigen Reagenzien
  • Unspezifische Nachweise organischer Verbindungen
    • Ioddampf (braune Flecke, unspezifisch, da nur durch Anlagerung entstehend)
    • Kaliumpermanganat (farblose Flecke auf violettem Untergrund, da nur an den Substanzflecken MnO₄^- zu Mn²⁺ reduziert wird, relativ unspezifisch)
  • Nachweis funktioneller Gruppen:
    •  

      Amine, Aminosäuren		Ninhydrin		violette Flecke
      aromatische Amine		NO2-/H+ / 2-Naphtol		rote Flecke
      Phenole, Hydroxamsäuren		FeCl3		violette Flecke
      Carbonylverbindungen		2,4-Dinitrophenylhydrazin		gelb-rote Flecke

  • Nachweis von Substanzklassen:
    •  

      Alkaloide		Dragendorff-Reagenz		orangerote Flecke
      Barbiturate		Diphenylcarbazon / HgCl2		violette Flecke
      Reduzierende Zucker		Anilinphtalat		braune Flecke, z.T. fluoreszierend

Leistungsbewertung

• Nachweisgrenze im ng-Bereich, gute Trennleistung, schnelle Durchführbarkeit, gute Reproduzierbarkeit. Diese guten Eigenschaften werden in der HPTLC noch einmal verbessert.
• Gute Detektierbarkeit.
• Relativ teure Verbrauchsmaterialien (Platten, hochreine Fließmittel).

• Siehe auch:
  • HPTLC